線粒體復(fù)合體Ⅳ試劑盒說明書

微量法
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
線粒體復(fù)合體Ⅳ又稱細(xì)胞色素C氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負(fù)責(zé)催化還原型細(xì)胞色素C的氧化，并最終把電子傳遞給氧，生成水。
測(cè)定原理：
還原型細(xì)胞色素C在550nm有特征光吸收，線粒體復(fù)合體Ⅳ催化還原型細(xì)胞色素C生成氧化型細(xì)胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能夠反映線粒體復(fù)合體Ⅳ酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體 100mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：液體 20mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：液體 1.5mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑四：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；
樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿 600g，4℃離心 5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心 10min。
4、上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅳ（此步可選做）。
5、步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于復(fù)合體Ⅳ酶活性測(cè)定。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定
（1）工作液的配制：臨用前將試劑五和試劑六依次轉(zhuǎn)移到試劑四中混合溶解，置于37℃（哺
乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑 4℃可保存一周；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和200μL工作液，混勻，立即記錄550nm
處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。
注意點(diǎn)： 若 ΔA 大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），
使 A1-A2 小于 0.2，可提高檢測(cè)靈敏度。
復(fù)合體Ⅳ活力單位的計(jì)算：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=1099×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力 (nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷（ε×d ）×10⁹]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=222×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.444×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.1×10 ^-4 L；ε：細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L/ mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。
b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=2198×ΔA÷Cpr
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g組織每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力 (nmol/min/g 鮮重 )=[ΔA×V反總÷（ε×d ）×10⁹]÷(W×V樣 ÷V樣總)÷T=444×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化降解1nmol還原型細(xì)胞色素C定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅳ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.888×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2.1×10 ^-4 L；ε：細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。